در رشته بیماری شناسی گیاهی

عنوان:

بررسی های آناستوموزی و تنوع ژنتیکی جدایه های R. solani عامل بیماری شانکر ساقه و شوره سیاه سیب زمینی

استاد راهنما

دکتر مهدی نصر اصفهانی

استاد مشاور

دکتر مهدی پیرنیا

تکه هایی از متن به عنوان نمونه :
فهرست مطالب
فهرست مطالب. ‌ه
فهرست جدول ها ‌ل
فهرست شکل ها ‌م
چکیده: 1
فصل اول: مقدمه. 3
کلیات. 3
1-1-معرفی گیاه سیب زمینی و اهمیت آن. 3
1-2-تاریخچه: 3
1-3-گیاه شناسی سیب زمینی 4
1-3-1-ریشه. 4
1-3-2-ساقه. 4
1-3-3-استولون. 4
1-3-4-غده 5
1-3-5-جست. 5
1-3-6-برگ. 5
1-3-7-گل آذین 5
1-4- ارقام مختلف. 5
1-4-1- رقم‌هاى خیلى ‌زودرس و زودرس. 6
1-4-2- رقم‌هاى متوسط رس یا میان‌رس. 6
1-4-3- رقم‌هاى دیررس. 6
1-5-الگوی رشد. 6
1-5-1-دوره ی قبل از سبز شدن و سبز شدن. 6
1-5-2-رشد برگ و ساقه. 7
1-5-3-رشد غده 7
1-6-ترکیبات موجود در سیب زمینی 7
1-7-طریقه کاشت و داشت سیب زمینی 7
1-8-شرایط خاک و میزان آب. 9
1-9-شرایط اکولوژیک. 10
1-10-خواص دارویی 10
1-11-اهمیت و توجیه اقتصادی سیب زمینی 11
1-12- بیماری های رایج 11
1-13-بیماری ریزوکتونیا 11
شکل1-1-الف: شانکر خشک ساقه   ب: شوره سیاه غده (وارتون و همکاران، 2009). 12
1-13-1-علایم بیماری 12
1-13-2-عامل بیماری 13
1-13-3- مشخصات مرفولوژیک R. solani 15
شکل1-2: قارچ R. solani (ویکیپدیا، 2011). 16
1-14-اهمیت اقتصادی بیماری 16
1-15-چرخه‌ی بیماری 17
شکل1-3-چرخه ی بیماری ریزوکتونیا توسط قارچR. solani((Whartonet al., 2009. 18
1-16-روش های کنترل. 19
1-16-1-کنترل شیمیایی 19
1-16-2-کنترل بیولوژیکی 19
1-16-3-ارقام مقاوم. 20
1-17-ژنتیک مقاومت. 20
1-18- انواع مقاومت. 21
1-18-1-مقاومت عمودی 21
1-18-2-مقاومت افقی 21
1-19-تاریخچه بیماری 21
1-20- تحقیق 24
– بررسی رابطه ی نتایج داده های مولکولی و بیماری زایی جدایه ها. 24
فصل دوم: مواد و روش ها 25
2-1-مشخصات آب و هوایی منطقه. 25
2-2-محل اجرای آزمایشات. 25
2-3- مشخصات خاکشناسی منطقه. 25
2-4-ژنوتیپ های مورد آزمون. 26
2-5- طرح آماری مورد استفاده 26
2-6-آماده سازی مزرعه و گلخانه برای کشت. 26
2-6-1-تاریخ کاشت. 26
2-6-2-عملیات کاشت. 27
2-6-3-برداشت. 27
2-7- جامعه ی آماری 27
2-8-نمونه برداری و جداسازی قارچهای عامل بیماری: 27
2-9-محیط کشت های لازم برای جداسازی و خالص سازی قارچ: 28
2-9-1- محیط کشت آب– آگار(WA) : 28
2-9-2- محیط کشت سیب زمینی، دکستروز، آگار (PDA): 28
2-9-3- محیط کشت مایع (PDB) : 29
2-10-خالص سازی قارچ به روش کشت مجدد: 29
2-11-نگهداری کشت خالص قارچ: 30
2-11-1- نگهداری قارچ عامل بیماری 30
2-12-بررسی آزمایشگاهی جدایه‌ها 31
2-12-1-اندازه گیری رشد شعاعی جدایه ها 31
2-12-2-تعیین قطر ریسه. 31
2-12-3-رنگ آمیزی هسته. 31
2-12-4-بررسی خصوصیات مرفولوژیکی جدایه ها 32
2-12-5-تعیین گروه های آناستوموزی جدایه ها 32
2-12-6-اثبات بیماری زایی 33
شکل2-1: شاخص بیماری شوره سیاه برحسب شدت و ضعف بیماری روی غده گیاه سیب‌زمینی(Anon., 1985)  34
شکل2-2-: شاخص بیماری شانکر خشک برحسب شدت و ضعف بیماری روی ساقه گیاه سیب‌زمینی   35
2-12-7- بررسی جدایه های Rhizoctonia از استولون های سیب زمینی و اثبات بیماری زایی آن ها بر روی گونه های گیاهی دیگر. 35
2-13-تجزیه و تحلیل آماری 36
2-14-بررسی تنوع ژنتیکی جدایه ها 36
2-14-1-خالص کردن جدایه ها 37
2-14-2- تولید انبوه میسلیوم. 37
2-14-3-استخراج DNA 37
2-14-4-آنالیز نتایج حاصل از RAPD 41
2-14-5- آزمایش PCR – RFLP برای گروه بندی رایزوکتونیا 41
2-14-6 الکتروفورز محصول PCR-RFLP. 42
2-14-7 الکتروفورز محصول PCR-RFLP(محصول PCR تکثیر یافته با آغازگرITS4_ITS5). 42
فصل سوم: نتایج 44
3-1- بررسی های آزمایشگاهی 44
3-1-1- روند رشد جدایه های قارچ عامل بیماری مورد آزمون. 44
3-1-2-تجزیه ی خوشه ای روند رشد جدایه های قارچی 45
شکل(3-1): دندروگرام روند رشد جدایه های قارچ عامل بیماری 47
3-1-3- مشاهدات رنگ کلونی قارچ عامل بیماری 47
3-1-4- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا به تفکیک مشاهدات رنگ کلونی 48
شکل (3-2): مقایسه رنگ کلونی جدایه های قارچ عامل بیماری 50
3-1-5- بررسی های میکروسکوپی ناشی از اندازه گیری قطر میسلیوم ها 50
3-1-6-تجزیه ی خوشه ای جدایه های عامل بیماری شوره سیاه بر اساس قطر میسلیوم. 51
شکل(3-3): مقایسه قطر میسلیومی جدایه های عامل شوره سیاه 53
3-1-8-تجزیه ی خوشه ای جدایه های عامل بیماری شانکر رایزوکتونیایی بر اساس مقدار تولید اسکلروت. 54
شکل(3-4): مقایسه‌ی مقدار تولید اسکلروت جدایه های قارچ عامل شانکر رایزوکتونیایی 56
3-2- مطالعه ی اثبات بیماریزایی جدایه ها 56
3-2-1- درصد آلودگی 57
3-2-2- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا بر اساس درصد آلودگی 57
شکل(3-5): مقایسه ی درصد آلودگی جدایه های قارچ رایزوکتونیا 59
3-2-3- شدت بیماری 60
شکل(3-6): مقایسه‌ی شدت بیماری جدایه های قارچ عامل بیماری 62
3-2-5- شاخص بیماری 63
3-2-6- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا بر اساس شاخص آلودگی 63
شکل(3-7): مقایسه ی شاخص بیماری جدایه های قارچ رایزوکتونیا 65
3-2-7- تجزیه ی خوشه ای جدایه های رایزوکتونیا بر اساس نمودار کلی درصد، شدت و شاخص بیماری 65
شکل(3-8): کلی درصد، شدت و شاخص بیماری جدایه های رایزوکتونیا 66
3-2-8- بررسی ضرایب همبستگی صفات کمی و کیفی جدایه های رایزوکتونیا 67
3-3- بررسی نتایج آناستوموزی بین جدایه های R.solani 68
3-3-1-مشخصات جدایه های R.solani AG-3. 68
3-3-2-مشخصات جدایه های R.solani AG-4. 68
3-3-3- مشخصات جدایه های 2-AG  R.solani 69
3-3-4- مشخصات جدایه های 1-1 AG  R.solani 69
3-4- بررسی اثبات بیماری زایی جدایه های Rhizoctonia بر روی گونه های گیاهی دیگر. 69
3-5- بررسی تنوع ژنتیکی قارچ Rhizoctonia solani سیب زمینی با بهره گرفتن از نشانگر RAPD 71
شکل (3-9-الف): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 1 تا 15 قارچ Rhizoctonia solani 72
شکل (3-9-ب): الگوی باندی RAPD حاصل از تکثیر جدایه های 16 تا 30 قارچ Rhizoctonia solani 73
شکل (3-10): دندروگرام بدست آمده از بررسی نتایج RAPDبا استفاده از روش UPGMA و ضریب جاکارد  74
استخراج DNA 75
شکل (3-11) : استخراج DNA از جدایه های مختلف رایزوکتونیاییM. 75
واکنش PCR از توالی های منطقه ITS : 76
آنالیز RFLP- PCR جدایه های رایزوکتونیا و گروه بندی جدایه ها 77
فصل چهارم: بحث. 78
4- 1-بررسی های بیماری زایی جدایه ها 81
4-1-1- درصد آلودگی 81
4-1-2- شدت بیماری 81
4-1-3- شاخص بیماری 82
پیشنهادات: 84
پیوست ها 86
شکل (1)-تصاویر آلودگی غده ها ارقام مختلف سیب زمینی به بیماری شوره سیاه 88
شکل (2)-تصاویر مختلف آلودگی ساقه و استولون های سیب زمینی به بیماری شانکر ریزوکتونیایی ساقه  88
شکل (3)تنوع رنگ کلونی ها ی جدایه های رایزوکتونیا 89
شکل(4)مشاهده میکروسکوپی ریسه های قارچ رایزوکتونیا 89
شکل(5) ایجاد واکنش آناستوموزی جدایه های رایزوکتونیا روی پرگنه. 90
شکل(6)شکل میکروسکوپی سمت راست واکنش آناستوموزی از نوع C0 و شکل سمت چپ واکنش آناستوموزی از نوع C2. 90
شکل(7) مایه ی اینوکلوم اولیه جدایه ها برای تلقیح روی گونه های گیاهی جهت آزمایش گروه های آناستوموزی(AG)  91
شکل(8)گونه های گیاهی طالبی، چغندر، گوجه فرنگی و فلفل کاشته شده جهت اثبات آزمایش گروه های آناستوموزی(AG). 91
چکیده:
سیب زمینی با نام علمی(L. tuberosum (Solanum با سطح زیر کشت 18 میلیون هکتار پس از گندم، جو و برنج از مهم ترین محصولات کشاورزی در جیره ی غذایی به شمار می رود. بر اساس آمار منتشره، سطح زیر کشت سیب زمینی در ایران 173 هزار هکتار و میزان تولید آن 21/4 میلیون تن در سال برآورد شده است. هم اکنون، بیماری ریزوکتونیا در اثر solani Rhizoctonia از بیمار ی های مهم مزارع سیب زمینی کشور است که با علایم شانکر خشک و شوره سیاه ظاهر می شود و موجب کور شدن استولن ها می گردد. لذا، محصول را به شدت کاهش می دهد. به منظور بررسی ویژگی­های فنولوژیکی، مورفولوژیکی، آناستوموزی و هم چنین بیماری­زایی جدایه­های R. solani ، 300 نمونه­ی آلوده از مناطق مهم سیب­زمینی کاری کشور شامل استان­های همدان، اردبیل، فارس، اصفهان، کردستان و کرمان جمع­آوری، جداسازی و خالص سازی شد، روند رشد جدایه­ها روی محیط کشت­ PDA ، تفاوت در رنگ کلنی­ جدایه­ها، تعیین قطر ریسه ها و میزان تولید اسکلروت بررسی گردید. بررسی ها از نظر بیماری­زایی جدایه­ها روی گیاه سیب­زمینی، رقم مارفونا در شرایط گلخانه مورد مقایسه قرار گرفت. با توجه به اهمیت موضوع بررسی هایی نیزدر خصوص تفاوت جدایه ها در تنوع ژنتیکی جدایه ها با بهره گرفتن از روش های مولکولی RAPD و PCR-RFLP انجام گردید. برای تعیین گروه های آناستوموزی از نظر ژنتیکی در این مناطق، با بهره گرفتن از واکنش زنجیره ای PCR از منطقه ITS ، آلودگی تعدادی از آن ها به بیماری رایزوکتونیا تایید شد. سپس منطقه ی تکثیر شده با آنزیم هایی مانند TaqI ,EcoRI ,AluI و چند آنزیم برشی دیگر مورد هضم آنزیمی قرار گرفت. براساس مقایسه ی الگوی برش آنزیمی، جدایه ها به چندگروه تقسیم شدند. بررسی­های آزمایشگاهی نشان داد که در محیط کشت PDA بیشترین میزان رشد متعلق به اصفهان 1 و کمترین مربوط به نمین 8 و اسدآباد 1 بوده است. رنگ کلنی­ جدایه­ها از کرم تا قهوه­ای تیره متفاوت بوده که شاخص موبوطه اثر معنی­دار داشت. هم­چنین، مشخص گردید که بیش ترین میزان تولید اسکلروت به ترتیب مربوط به سنندج 2 و کم ترین میزان متعلق به جیرفت 3، اقلید 4 و 5، آباده 1، کازرون 3، رزن 2، گلپایگان 2، سمیرم 3 و 4 و اصفهان 1 می­باشد. اندازه گیری قطر میسلیوم نشان داد که جدایه ی روستای نیاز(اردبیل) دارای بیشترین قطر و جدایه های سمیرم 3، گلپایگان 2 و اقلید 5 دارای کمترین قطر می باشند. بررسی شاخص­ بیماری­زایی جدایه­ها نیز تفاوت­های قابل توجه با اثری معنی­دار را نشان داد بدین ترتیب که بیشترین شدت بیماری متعلق به جیرفت 5 (86.1) و اصفهان 5 (80.55) و کمترین شدت بیماری متعلق به سمیرم 4 (15) و رزن 2 (33.3) اختصاص داده شد. مقایسه توالی های نوکلئوتیدی این جدایه ها با جدایه های موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های مرتبط به میزان 99% با توالی های ثبت شده مرتبط با رایزوکتونیا مشابهت دارند و بر مبنای واکنش های انجام شده جدایه های جمع آوری شده در چهار گروه آناستوموزی AG3، AG4، AG2، AG1 گروه بندی شدند. گروه غالب در میان جدایه های مورد بررسی، گروه آناستوموزی AG3 با 83.3 ? بود.
واژه‌های کلیدی: سیب زمینی، ریزوکتونیا، جدایه، آناستوموزی، ژنتیک ، RAPD،RFLP ، فنولوژیکی، مورفولوژیکی، اصفهان
کلیات
1-1-معرفی گیاه سیب زمینی و اهمیت آن
سیب زمینی (Solanum tuberosum L.) محصول غذایی پراهمیتی است که به دلیل سازگاری با شرایط محیطی متفاوت، پتانسیل باقی ماندن برای نسل ها را با توجه به افزایش جمعیت جهان داراست. سیب‌زمینی از نظر مقدار تولید، چهارمین محصول جهان پس از گندم، برنج و ذرت می باشد Anon, 1985)).
این محصول در ناحیه ای از کوه های آند واقع در آمریکای جنوبی کشف شده است. ساکنین این منطقه به گواهی باستان شناسان، هفت هزار سال پیش این گیاه را کشت و از ریشه ی مغذی آن به عنوان غذا استفاده می کردند. این محصول پرارزش حدود 250 سال بعد از رواج آن در اروپا، در زمان فتحعلی شاه قاجار وارد ایران شد (حیدرنیا، 1365). تحقیقات سیب زمینی در ایران از سال 1339 با وارد نمودن ارقام مختلف از کشورهای هلند، آلمان و انگلستان شروع گردید.
براساس رده‌بندی Cronquist سیب‌زمینی در فرمانرو گیاهان، شاخه‌ی Angiosperms زیرشاخه‌ی Magnoliophyta رده‌ی Magnoliopsida زیر رده‌ی Asteridae، راسته‌ی Solanales، تیره‌ی Solonaceae، جنس Solanum، گونه‌ی tuberosum با نام علمی tuberosum Solanum می‌باشد(,Cronquist 1988).
از خانواده یSolanaceae ، فقط گونه ی Solanum tuberosum در سطح جهان کشت می گردد و بقیه ی گونه های آن محدود به کوه های آند واقع در آمریکای جنوبی می باشد که در این مناطق گونه های وحشی از آن یافت می شود. تغییرات جوی اخیر در دنیا گونه های وحشی سیب زمینی را در معرض خطر نابودی قرار داده است و تهدیدی جدی بر علیه منابع ژنتیکی ارزشمند در مقابله با آفات گیاهی و مقاومت در برابر خشکسالی به شمار می آید. چرا که عوامل ژنتیکی یافت شده در گونه های وحشی منجر به تولید انواع جدیدی از سیب زمینی های غیر وحشی و مقاوم می شود که مقاومت این گیاه را در برابر عوامل آسیب رسان افزایش می دهد، طی پیش بینی کارشناسان در 50 سال آینده بیش از 60 درصد از این گونه ها منقرض خواهند شد.
1-2-تاریخچه:
دانشمندان آمریکایی دریافته‌اند که سرمنشأ کلیه انواع سیب زمینی‌های امروزی را می‌توان در یک گیاه واحد که بیش از هفت هزار سال قبل در کشور پرورشد می کرده ردگیری کرد (Sinkovec and Magdalena, 2004).
سیب­زمینی در حوالی سال 1570 توسط فاتحان اسپانیایی از آمریکای جنوبی به آن کشور منتقل شد و کشت آن در سراسر اروپا رواج یافت. سیب زمینی بعداً توسط مستعمره نشین‌های بریتانیایی به آمریکای شمالی منتقل شد(Hijmans, 2001).
براساس آمار و اسناد قدیمی ‌تاریخ ورود این گیاه به ایران به عهد قاجاریه می‌رسد(Laufer,1938). بعد از آن اطلاعاتی در ارتباط با چگونگی ورود ، انتقال و گسترش آن در سطح کشور در دست نیست تا اینکه ارقام پشندی و استانبولی در سطح نسبتا زیادی در مناطق کوهستانی شمال کشور کشت و کار شده است (George,1978). از سالهای 1340 توسعه کشت سیب زمینی در مناطق مختلف کشورشروع شده و در دهه 50 در اغلب استانها و مناطق، تولید آن توسعه یافته است و به عنوان سومین محصول بعد از گندم و برنج در تامین نشاسته مورد نیاز در تغذیه مردم ایران قرار دارد(مجیدی و داوودی، 1382).
1-3-گیاه شناسی سیب زمینی
سیب زمینی گیاهی یک ساله از گیاهان عالی گلدار و از رده دولپه ای ها است. در ذیل بخش های مختلف آن به اختصار توضیح داده می شود.
1-3-1-ریشه
بوته های رشد یافته از بذرهای حقیقی، یک ریشه راست و باریک توسعه می دهند. که از آن، انشعابات جانبی به وجود می آید. بوته های رشد یافته از غده در گره های ساقه زیر زمینی و استولون، تولید ریشه نابجا می کنند. در سیب زمینی، ریشه ها عموماً کم عمق هستند (اغلب 40 تا 50 سانتی متر).
1-3-2-ساقه
سیستم ساقه در سیب‌زمینی شامل ساقه، استولون و غده می‌باشد. ساقه معمولا سبز، نسبتاً کلفت (به قطر تقریبی 5/2 -2 سانتی متر) منشعب و کمی زاویه دار است (طباطبایی، 1365).
 1-3-3-استولون
استولون‌ها، ساقه‌های جانبی هستند که به طور افقی از جوانه‌های موجود روی بخش زیرزمینی ساقه شکل می‌گیرند (Dclorit & Greub, 1984)، طول آن ها متغیر بوده به طوری که به عنوان پارامتر مشخص کننده‌ی رقم به شمار می‌روند. در اثر حجیم شدن انتهای استولون‌ها غده تشکیل می‌شود، ولی همه‌ی استولون‌ها تشکیل غده نمی‌دهند.
1-3-4-غده
غده، ساقه‌ی تغییر شکل یافته است که عضو اصلی ذخیره در گیاه می باشد(Kipps, 1970). اندازه ی غده متناسب با نوع واریته، شرایط خاک و اقلیم است و دارای اشکال گرد، بیضی و یا تخم مرغی شکل هستند. پوست غده به رنگ های زرد، نارنجی، قرمز، ارغوانی و کرم دیده می شود.
1-3-5-جست
با رشد جوانه‌ها در چشم‌های غده ی سیب‌زمینی، جست‌ها تشکیل می‌شوند. در شرایط مساعد جست‌ها سریعاً رشد کرده و ساقه و ریشه ی اصلی را تولید می‌کنند. رنگ‌های مختلف جست‌ها در شناسایی ارقام مختلف سیب‌زمینی اهمیت دارند (طباطبایی، 1365).
1-3-6-برگ
برگ ها مرکب یک بارشانه ای و فرو شانه ای است یعنی در انتهای دمبرگ اصلی هم یک برگچه دیده می شود که با فیلوتاکسی مارپیچی روی ساقه آرایش یافته اند. دمبرگ اصلی علفی و معمولا کمی خمیده و به رنگ سبز روشن است که در روی آن 7-9 برگچه قرار گرفته است.
1-3-7-گل آذین
سیب زمینی دارای گل‌آذین گرزن و گل‌های دو جنسی، سفید مایل به بنفش است (Jones & Luchsinger, 1987). گل ها خوشه ای دیهیم، نسبتاً درشت، پیوسته گلبرگ و دارای 5 کاسبرگ و5 گلبرگ می باشند. پرچم ها کوتاه و به هم چسبیده، 5 عدد، دارای بساک زرد مشخص در دور مادگی، مادگی دارای 5 برچه به هم چسبیده می باشد. میوه ی آن سته کوچک به قطر چند میلی متر، ابتدا سبز، و بعد به تدریج تیره و سیاه یا زرد می شود.
در سیب زمینی بعضی ارقام به دلیل نر عقیمی بذر تولید نمی کنند. به طور کلی عقیمی دانه ی گرده به وفور دیده می شود. بذر تولید شده به دلیل هتروزیگوسیتی شدید در زراعت مورد استفاده قرار نمی گیرد و فقط در اصلاح نباتات کاربرد دارد.
1-4- ارقام مختلف
این گیاه دارایارقام مختلفی است که آنها را به زودرس، دیررس و میانه‌رس تقسیم می‌­کند:
1-4-1- رقم‌هاى خیلى ‌زودرس و زودرس
دوره کامل براى رشد و تولید غده در رقم­‌هاى خیلى‌زودرس 70 تا 80 روز و در رقم­‌هاى زودرس 80 تا 90 روز است. عملکرد این ارقام در مقایسه با رقم‌هاى دیررس کم­‌تر است که به‌علت بالا بودن درصد آب در غده، کم بودن ماده خشک و نازکى پوست غده، قابل ذخیره به‌صورت انبارى نیست و باید تازه مصرف شود. این رقم‌ها به سیب‌زمینى بهاره معروف هستند. مارفونا، سینورا، فونتانه، اوشینا و ناتاشا از ارقام بهاره رایج در ایران است (حسن پناه و حسن آبادی،1389).
1-4-2- رقم­‌هاى متوسط رس یا میان‌رس
در این رقم‌ها زمان لازم براى رسیدن و تولید غده 100 تا 120 روز است و به‌ارقام تابستانه معروف هستند. ساتینا، مارکیز و آرکونا از ارقام رایج میان رس کشت شده در ایران است(حسن پناه و حسن